荧光定量PCR仪的PCR管如何选择

一、客户反馈

最近有客户反馈，在某猪场实验室的Gentier 96R荧光PCR仪使用非洲猪瘟P72、MGF、CD2v三基因检测试剂盒，设置的阳性对照某个通道无阳性扩增，阳性对照本应出现4条曲线，结果只有Fam-p72、Hex-MGF、Rox-内参这3个通道有扩增曲线，Cy5-CD2v通道无信号，扩增曲线平台期RFU值较低。

如图1所示：

图1：更换PCR管前荧光曲线

通过与实验人员沟通，实验室使用的是Gentier 96R荧光定量PCR仪，PCR管为0.2ml 透明+平盖透明八联管（图3A）。查阅荧光定量PCR仪说明书，发现该款PCR仪采用顶部激发及扫描的方式读取信号，这种信号采集方式的荧光定量PCR仪，需要适配白色+平盖透明八联管，才能发挥最好的信号读取性能。

二、解决方案

实验人员更换0.2ml白色+平盖透明八联管（图3B）进行上机实验，阳性对照4个通道均正常显示扩增曲线，呈现典型S型，且扩增曲线平台期RFU值也很高。

如图2所示：

图2：更换白色PCR管后的扩增曲线

由此可以发现，荧光定量PCR仪所使用的PCR管，是一个非常重要的耗材，其性能及规格是否与PCR仪匹配，能直接影响实验结果。

三、如何选择适合设备的PCR管

市场上的PCR管耗材琳琅满目，品牌与规格繁多，价格上也千差万别，下到几十块钱一包，上到大几百块钱一包。目前主要使用的PCR管有：0.2mL透明单管、0.1mL透明单管、0.2mL透明八联管、0.2mL白色八联管、0.1mL透明八联管、0.1mL白色八联管等等。那么如何去针对不同的场景，选择合适的PCR管？

图3：A为透明+平盖透明八联管、B为白色+平盖透明八联管

市面上常见的荧光定量PCR仪一般有以下信号采集模式：顶部激发和扫描（图4A）、底部激发和扫描（图4B）。

图4：A为顶部激发和扫描、B为底部激发和扫描

3.1.顶部激发和扫描

对于顶部激发和扫描的荧光定量PCR仪（图4A），白色的管壁能够阻止荧光穿过管壁和折射（图5A），防止荧光传至加热模块（放管子的金属孔壁），被模块吸收或发生不一致反射等情况。相比于透明管，在白管的顶端能够采集到更强，更聚焦的荧光信号（图5B）。

图5：透明管和白色管在顶部激发和扫描的荧光PCR仪上信号强度差异

3.2.底部激发和扫描

对于底部激发和扫描的荧光定量PCR仪（图4B），光路图为图6所示，则必须采用薄壁透明管才能让光线更好的通过。如果采用白色管，会阻挡光信号的激发和采集，导致荧光信号强度特别差，影响Ct值和结果。图7是相同试剂分别放在透明管和白色管中，置于底部激发和扫描的荧光定量PCR仪里进行检测，得到的数据，PCR仪上透明管读取到的信号强度要远高于白色管，Ct值也明显提前，差别是非常明显的。

图6：底部激发和扫描的荧光PCR仪光路图

图7：透明管和白色管分别在底部激发和扫描的荧光PCR仪上信号强度差异

3.3.PCR管材质

PCR管的材质也特别重要。采用材质差的八联管，可能会出现如下情况：

1.盖的不严实，容易盖子崩开，或运行过程中液体蒸发，导致扩增产物污染，造成实验室检测假阳性。

2.透光性差，容易影响荧光PCR仪对信号的采集。

3.有可能会包含PCR反应抑制物，抑制PCR的反应，导致扩增效率低下。

图8：不同体积PCR管的高度差示意图

四、总结

实验室在采购荧光定量PCR仪使用PCR管时，建议咨询仪器设备厂家，明确相关的技术标准。不要购买质量太差的PCR管，否则可能导致结果无效，浪费试剂，严重情况下甚至会造成实验室扩增产物污染。

湖南国测生物科技有限公司提供的猪警2000+荧光定量PCR仪为底部激发和扫描的方式，适配0.2ml 透明+平盖透明八联管，欢迎广大客户咨询订购。