猪用生物制品及相关猪源原辅材料中 非洲猪瘟病毒核酸检测方法

　　附件

1适用范围
　　1.1猪用及采用猪源原辅材料制备的生物制品成品及半成品。
　　1.2猪源毒种。
　　1.3猪源细胞及相关制品生产用细胞。
　　1.4其他猪源原辅材料（如组织、血清、胰酶衍生物等）。

2取样和处理

　　2.1疫苗
　　2.1.1活疫苗取至少2瓶样品，按瓶签注明头份用适宜稀释液分别稀释成10头份/0.2ml，等量混合，取混合液进行核酸提取。
　　2.1.2灭活疫苗取至少2瓶样品，等量混合后进行以下处理。
　　2.1.2.1油佐剂灭活疫苗取36 ml混合疫苗，加入正戊醇4.0 ml，充分振荡混合1分钟，2～8℃冰箱静置不少于60分钟，直至油相和水相分离。取水相进行核酸提取。
　　2.1.2.2水性佐剂灭活疫苗
　　2.1.2.2.1铝胶佐剂灭活疫苗取混合疫苗5.0 ml，摇匀，加入0.25
　　g解离剂CPG-odn（人工合成的寡聚核苷酸），放入摇床（200 r/min）
　　37℃解离1小时，5000 r/min离心10分钟，取上清液进行核酸提取。
　　2.1.2.2.2其他水性佐剂灭活疫苗直接取混合样品进行核酸提取。
　　2.2其他生物制品和半成品冻干类制品，按活疫苗进行取样和处理；液体制品及半成品，取至少2份（瓶）样品，等量混合，取混合液进行核酸提取。
　　2.3猪源毒种取至少2支毒种。冻干毒种，按冻干前体积复溶后等量混合，取混合液进行核酸提取；非冻干毒种，等量混合后直接取混合液进行核酸提取。
　　2.4猪源细胞除另有规定外，取至少2瓶细胞浓度不少于107.0个细胞/ml的细胞悬液进行核酸提取。
　　2.5其他猪源原辅材料
　　2.5.1猪组织每种组织，分别取样和处理。取不少于2.0 g组织，
　　研磨后用5倍体积灭菌PBS悬浮，70℃灭活30分钟，4℃下以2000～
　　3000 g离心10分钟，取上清液进行核酸提取。
　　2.5.2猪血清每批血清取至少2个小包装的样品，等量混合，取混合液进行核酸提取。
　　2.5.3猪胰酶干粉状胰酶，取至少2份样品，根据使用情况分别配制成不低于2.5%浓度的溶液，等量混合，取混合液进行核酸提取；液体胰酶，取至少2个小包装的样品，等量混合，取混合液进行核酸提取。
　　2.5.4其他猪源衍生物固体、液体或干粉状猪源衍生物，可分别按组织、血清或干粉状胰酶的方法进行取样和样品处理。

3核酸提取

　　3.1试剂和器材
　　3.1.1试剂根据核酸提取方法确定，如氯仿、异丙醇、无水乙醇、0.1 mol/l柠檬酸钠（含10%乙醇）、75%乙醇等。
　　3.1.2仪器核酸含量测定仪；常温台式离心机；旋涡振荡器；水浴锅；微量移液器1套（大量程分别为10µl、100µl、200µl、1000µl）。
　　3.1.3耗材1.5 ml带盖离心管、无菌吸头（0～10µl、0～200µl、
　　100～1000µl）、一次性乳胶手套。
　　3.2操作程序（TRIZOL法），也可以选择其他等效核酸提取方法提取样品中的DNA。
　　3.2.1取样品250µl，加入750µl Trizol，颠倒混匀，室温放置5分钟。
　　3.2.2加入200µl氯仿，充分混匀，室温放置10分钟，4℃下以
　　12000 g离心15分钟。
　　3.2.3弃去上清液，加入220µl无水乙醇，颠倒混合，15～30℃放置2～3分钟，2～8℃以2000 g离心5分钟，沉淀物为DNA。
　　3.2.4弃去上清液，加入含10%乙醇的0.1 mol/l柠檬酸钠750µl洗涤DNA，15～30℃放置30分钟，2～8℃以2000 g离心5分钟。重复一次。
　　3.2.5加入75%乙醇1.2 ml，重悬DNA沉淀，15～30℃放置20分钟，4℃2000 g离心5分钟。可重复一次，充分洗涤DNA沉淀。
　　3.2.6弃去上清液，敞开离心管管口，在空气中干燥5～10分钟，
　　加入30～50μl的无核酸酶灭菌水溶解DNA，－20℃以下保存备用。
　　3.3注意事项
　　3.3.1核酸提取试剂具有腐蚀和强变性能力，应做好个人防护，佩戴手套、口罩和护目镜，防止液体飞溅到皮肤和眼睛。
　　3.3.2后续的核酸检测敏感性很高，要防止样品之间相互污染，使用带滤芯的枪头，且每次吸取取液体时均需更换枪头。
　　3.3.3为防止核苷酸降解，应避免核酸酶污染，使用的耗材均需无核酸酶。
　　3.3.4做好剩余样品的无害化处理及操作台面的消毒处理。剩余样品可通过高压灭菌或煮沸处理，也可放在1%卫可或2%氢氧化钠消毒液中浸泡处理，操作台面使用1%卫可擦拭。
　　3.3.5提取后的DNA样品要用锡箔纸封存，取样时应用枪头直接刺破锡箔纸取样，防止污染。

4检测

　　下列两种方法可任选其一。
　　4.1实时荧光定量PCR检测法
　　4.1.1试剂和器材
　　4.1.1.1试剂
　　4.1.1.1.1荧光定量PCR试剂本操作中以Applied Biosystems
　　TaqMan Gene Expression Assays kit为例，也可选用其他荧光定量PCR试剂。
　　4.1.1.1.2扩增引物及探针扩增引物：
　　ASF-05-Zsak-1466F（10µmol/L）：5'-CCTCGGCGAGCGCTTTATCAC-3'ASF-05-Zsak-1528R（10µmol/L）：5'-GGAAACTCATTCACCAAATCCTT-3'探针ASF-05-Zsak-1486prob(10µmol/L)：
　　5'-FAM-CGATGCAAGCTTTAT-MGB-3'
　　4.1.1.1.3无核酸酶的灭菌水PCR级别。
　　4.1.1.2仪器荧光定量PCR仪；微量移液器1套（大量程分别
　　为10µl、100µl、200µl、1000µl）。
　　4.1.1.3耗材1.5 ml带盖离心管、0.2 ml薄壁PCR管、荧光定量PCR 96孔板、0.1 ml荧光PCR八连管、无菌吸头（0～10µl、0～200µl、
　　100～1000µl）、一次性乳胶手套。4.1.2操作程序
　　4.1.2.1样品DNA制备按照前述方法进行核酸提取。
　　4.1.2.2反应体系的配制配制比样品数量至少多4个的反应体系，同时设置强阳性、弱阳性和阴性对照。在强阳性和弱阳性对照反应管中分别加入含有非洲猪瘟P72基因的标准质粒DNA各3µl，在阴性对照反应管中加入3µl无核酸酶灭菌水。每个PCR反应管中应包含以下成分：
　　成分体积（µl）
　　2×ABI TaqMan Gene ExpressionMix 10
　　ASF-05-Zsak-1466F（10µmol/L）1
　　ASF-05-Zsak-1528R（10µmol/L）1
　　探针(10µmol/L)0.8
　　DNA 3
　　无核酸酶灭菌水
　　4.2
　　总量20
　　4.1.2.3反应程序将所有待检样品和强阳性、弱阳性、阴性对照反应管放在荧光定量PCR仪中，按照以下程序进行扩增：50℃2分钟，95℃5分钟，95℃15秒，58℃退火延伸1分钟，45个循环（荧光信号收集在此阶段每次循环的退火延伸时进行）。
　　4.1.2.4结果判定
　　4.1.2.4.1阈值设定试验操作结束后，确定Ct值。Ct值为每个样品反应管内荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数。
　　阈值设定原则：根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过阴性对照扩增曲线的高点为准。
　　4.1.2.4.2质控标准
　　对照组的检测结果应符合以下情况，此次检测方为有效：阴性对照无Ct值，且无扩增曲线。
　　强阳性对照的Ct值应在18～22之间，并出现典型的扩增曲线。弱阳性对照的Ct值应在33～35之间，并出现典型的扩增曲线。
　　4.1.2.4.3判定
　　阴性：无Ct值，且未出现扩增曲线，判定为样品中无ASFV核酸。
　　阳性：Ct值≤40，且出现典型的扩增曲线，判定为样品中存在ASFV核酸。
　　可疑：Ct值>40，且出现典型扩增曲线，判定为可疑，应重检。重检后，Ct值≤40且出现典型扩增曲线者判为阳性，其他情况均判定为阴性。
　　4.2普通PCR检测法
　　4.2.1试剂和器材
　　4.2.1.1试剂
　　4.2.1.1.1 PCR试剂10×PCR缓冲液（含25 mmol/l Mg2+），DNA
　　扩增酶，dNTP预混液。
　　4.2.1.1.2扩增引物
　　primer PPA-1（10μmol/L）：5'-AGTTATGGGAAACCCGACCC-3'(上游引
　　物)；primer PPA-2（10μmol/L）：5'-CCCTGAATCGGAGCATCCT-3'(下游引物)。
　　4.2.1.1.3 DNA分子量标准品DL500。
　　4.2.1.1.4 TAE电泳缓冲液配制方法见《电泳液标准配制流程》。
　　4.2.1.1.5 1%琼脂糖凝胶板在100 ml 1×TAE缓冲液中加入1g琼脂糖，加热融化，加入5.0μl(10 mg/ml)溴化乙锭，混匀，倒入水平放置的凝胶盘中，胶板厚度达5.0 mm左右。根据样品数量选用适宜的梳子。待凝胶冷却凝固后拔出梳子(胶中形成加样孔)，放入电泳槽中，加1×TAE缓冲液淹没胶面。
　　4.2.1.2仪器DNA扩增仪，稳压稳流电泳仪，水平电泳槽，凝胶成相系统（或紫外透射仪），微量移液器1套。
　　4.2.1.3耗材1.5 ml带盖离心管、0.2 ml薄壁PCR管、无菌吸头
　　（0～10µl、0～200µl、100～1000µl）。4.2.2操作程序
　　4.2.2.1样品DNA制备按照前述方法进行核酸提取。
　　4.2.2.2反应体系的配制配制比样品数量至少多3个的反应体系，同时设立阳性和阴性对照。在阳性对照反应管中加入非洲猪瘟P72基因重组质粒2.0µl，在阴性对照反应管中加入2.0µl无核酸酶灭菌水。
　　每个PCR反应管中应包含以下成分：
　　成分体积（µl）
　　10×PCR缓冲液2
　　DNA扩增酶1
　　dNTP 0.5
　　PPA-1(10μmol/L)1
　　PPA-2(10μmol/L)1
　　DNA 2
　　无核酸酶灭菌水
　　12.5
　　总量20
　　4.2.2.3反应程序将所有待检样品及阳性和阴性对照反应管放在PCR仪中，按照以下程序进行扩增：94℃2分钟，94℃30秒，60℃
　　30秒，72℃30秒，35个循环；72℃10分钟。4℃保存。
　　4.2.2.4 PCR扩增产物分析取PCR扩增产物10µl，加6×加样缓冲液2.0µl，混匀，用1.5%琼脂糖凝胶对混合物进行电泳分析，电压120V，电流50 mA，电泳时间30分钟。电泳结束后，用凝胶成像系统拍照，记录检测结果。
　　4.2.2.5结果判定
　　4.2.2.5.1质控标准
　　对照组的检测结果应符合以下情况，此次检测方为有效：阴性对照应不出现257bp的特异性条带。
　　阳性对照应出现257bp的特异性条带。
　　4.2.2.5.2判定
　　阳性：待检样品出现与阳性对照大小一致的扩增条带，判定为非洲猪瘟病毒核酸阳性，扩增产物可通过DNA测序进一步确定基因型。
　　阴性：待检样品未出现与阳性对照大小一致的扩增条带，判定为
　　非洲猪瘟病毒核酸阴性。
　　4.3注意事项
　　4.3.1检测过程中应遵循PCR实验分区原则，即应区分试剂配制区、样本处理区、核酸扩增区。
　　4.3.2应避免在含有靶序列的区域中使用引物，防止污染靶序列。