非瘟检测规律：汇总文献与临床实践中不同样本的检测情况

2021年2月军事科学院军事兽医研究所与哈兽研两篇“关于非洲猪瘟变异毒株”的重量级文章的相继发布，其中关于非瘟变异毒株感染而导致猪只潜伏期延长，临床表现轻微，感染该类毒株后排毒滴度低、间隙性排毒、难以早期发现等特性的报道，给当下困难重重的养猪业再次蒙上了一层阴影。作者查阅文献及对临床反馈的相关数据汇总，查找猪只不同样本中病毒含量或抗体含量消长规律，以期为猪场的非瘟防控提供一些思路。

1.唾液中非瘟病毒：

1.1 强毒株Pig/HLJ/18感染后唾液中病毒含量

2019年分离的强毒株Pig/HLJ/18株同居猪在第6天，唾液中可以检测到病毒，除第8天有一头同居猪中唾液含量较低，9-13天唾液中的病毒含量都较高。鉴于唾液采集的方便性及早期排毒，被广泛应用猪场的“拔牙”。（图1）

图1：ASFV  强毒株Pig/HLJ/18同居猪感染试验口腔拭子病毒滴度

1.2 非瘟变异毒株HLJ/HRB1/20感染后唾液中病毒含量

2021年分离的HLJ/HRB1/20毒株，同居猪第6天可以检测到病毒，但病毒在今后的一段时间，并未显著上升，在12天后出现降低，至28天完全检测不到。由于病毒在感染后，唾液中病毒滴度不高，且维持时间非常短暂，猪场对于疑似感染猪，可能存在漏检。（图2）

图2：ASFV  HLJ/HRB1/20同居猪感染试验口腔拭子病毒滴度

2.唾液中非瘟抗体：

鉴于非瘟变异毒株可能存在的排毒低，后期唾液中无病毒的背景下，是否可以通过检测唾液抗体筛查感染猪只呢？Luis G[1]等通过采集免疫NHV/P68后的17头猪唾液和血清，发现在血液和唾液中均存在P30蛋白的免疫反应，血清和唾液分别在第6天、第8天有显著的免疫反应，在第18天达到峰值。该研究结果可能有助于开发一款针对检测唾液中的抗体，从而筛查出阳性猪的试剂盒（传统上，通过采集前腔静脉血收集血清的方式，不利于非瘟的防控）。目前暂无商品化唾液检测抗体试剂盒，可能需要克服样本的采集、保存、二抗选择等问题。（图3）

图3：接种ASFV NHV/P68后血清和口腔液P30抗体反应间接ELISA

3.血液中非瘟病毒：

不同的病毒感染猪只后，血液中病毒含量稍有区别。强毒株Pig/HLJ/18感染后，第9天，血液中开始检测到病毒，且在之后血液中病毒含量保持高滴度（图4）；变异毒株HLJ/HRB1/20感染后，试验猪血液样本在第21天才检测到低含量病毒（图5）；尽管变异毒株在感染前期血液中的病毒含量偏低，但在后期，血液中的病毒含量会升高一些，因此依然需要采集；临床上因场内的生物安全防控，追求人猪接触少、猪只创口小、污染面可控，采血时可选择尾根血（图6）。

图4：ASFV 强毒株Pig/HLJ/18同居猪感染试验血液拭子病毒滴度

图5：HLJ/HRB1/20同居猪感染试验血液拭子病毒滴度

图6：尾根血采集

4.血液中非瘟抗体：

文献中未报道强毒株Pig/HLJ/18和HLJ/HRB1/20抗体产生时间，查阅其他毒株血清抗体消长情况：NHV/P68免疫试验同居猪的 ASF 病毒抗体产生需要 21 d 时间，而接种感染猪的抗体产生只需 4 d（图7）；伊比利亚半岛及西半球欧洲家猪血液中抗体产生时间最早在第12天，之后抗体滴度不断升高，耐过猪的血清抗体滴度维持较高水平（图8）。综上可知，病毒感染后在血液中抗体的产生时间晚于病毒在唾液中的排出时间，临床上应用血液抗体检测进行早期拔牙，可能效果不佳，但对于感染了弱毒株或者变异毒株较长时间的猪场，血液抗体筛查技术能给猪场提供不少帮助。

图7：NHV/P68接种后抗体产生时间

图8：伊比利亚半岛及西半球的欧洲家猪中观察到的血液中病毒和抗体随时间的变化及与ASF感染不同阶段的关系（1960-1995年）

5.肛拭子中非瘟病毒：

强毒株Pig/HLJ/18感染后，第10天可以在肛拭子中检测到病毒，但病毒低水平检出（图9）；变异毒株HLJ/HRB1/20感染后，肛拭子中检测到低水平间隙性带排毒，后期无排毒（图10）。文献给出的数据得知，肛拭子不适合作为早期或者变异毒株、耐过猪的检测样本。

图9：强毒株Pig/HLJ/18感染后肛拭子中病毒滴度

图10：变异毒株HLJ/HRB1/20肛拭子中病毒滴度

6.组织中非瘟病毒：

强毒株Pig/HLJ/18感染后，通过对肝脏、脾脏、心脏、结肠、上颌下淋巴结的带毒检测，显示肝脏、脾脏、淋巴结中的病毒含量很高（图11）；变异毒株HLJ/HRB1/20感染后，对心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、扁桃体、关节液、淋巴结病毒带毒检测，2头同居猪都能检测到的样本为支气管淋巴结和纵隔淋巴结（图12）。通过以上数据的分析，猪场出现死亡猪只后的非瘟确诊上，可以选择支气管淋巴结或纵隔淋巴结进行检测（注：需要在很严格的生物安全措施下进行，以免发生散毒）。

图11：强毒株Pig/HLJ/18在SPF猪中的复制和毒力

图12：变异毒株HLJ/HRB1/20感染后组织中带毒量

7.脐带血中非瘟病毒：

暂未有文献对非瘟病毒在脐带血中传播进行研究，但笔者在临床上遇到许多耐过猪场或免疫疫苗猪场，其母猪脐带血中携带病毒含量较高，因此脐带血可以作为猪场母猪是否感染变异毒株或疫苗毒的监控样本。

8.阴拭子中非瘟病毒：

暂未有文献报道非瘟病毒通过母猪阴道黏膜进行排毒，2021年初北方某猪场尝试采集同一头母猪的阴拭子和咽拭子进行检测，结果显示阴拭子的检测阳性率高于咽拭子，图13，但后续我们没有再获取更多数据，阴拭子是否适合进行检测，猪场实验室人员可以采集后验证。（在此感谢提供阴拭子检测结果的实验室）

图13：阴拭子与咽拭子检测结果

l  总  结：

当前非瘟病毒、疫苗毒株、变异毒株、弱毒株等不同毒株的出现，使非瘟的防控愈加复杂，特别是疫苗毒株、变异毒株导致的临床症状轻微、间歇性排毒等特点，更是给猪场非瘟防控增添了更多困难。
通过上述对不同样本的带毒量的分析和总结，猪场在进行前期筛查时可以选择：唾液+鼻液+尾根血+阴拭子样本的联合检测方式，提高检出率，特别对于感染了变异毒株的猪场而言，可能有出奇的效果。
对于耐过猪的筛查，或者疫苗毒株、变异毒株、弱毒株感染猪的筛查，猪场可以在核酸检测的基础上，增加抗体检测的方式。尽管目前采集血液比较困难，和可能增加感染风险，但面对无临床症状和无排毒的猪只，除了抗体筛查，暂时没有更好的方法，期待成熟的唾液抗体技术能尽快面世。
对于猪场病死猪检测，优先选择支气管淋巴结或纵隔淋巴结，非瘟病毒和变异毒株感染的猪只剖检样本中，淋巴结的检测阳性率最高。

参考文献：

[1] LG Giménez-Lirola, Mur L , Rivera B , et al. Detection of African Swine Fever Virus Antibodies in Serum and Oral Fluid Specimens Using a Recombinant Protein 30 (p30) Dual Matrix Indirect ELISA[J]. Plos One, 2016, 11(9):e0161230.